2.5.1 重組蛋白粗酶液的獲取 

(1) 挑取重組大腸桿菌菌落于LB Amp+培養基中，30oC培養，230rpm。 (2) 按1：100比例接種到新的LB Amp+培養基中，30oC培養，230rpm， OD600≈0.6時開始誘導，IPTG終濃度為0.75mmol。 (3) 誘導7h后，4oC，5000g，5min離心收集菌體； 

(4) 菌體用滅菌ddH2O重懸洗滌，4oC，5000g，5min離心收集菌體； (5) 用1×binding buffer重懸菌體，采用超聲破碎法破碎菌體； (6) 超聲破碎液于4oC，30000g，離心20min收集上清備用。 2.5.2 Ni2+柱的活化 

(1) 充分懸浮柱填料保存液，取2mL裝入柱中，靜置（柱體積CV：1.5mL）； (2) 設置柱流速10CV/h，待柱中保存的20%乙醇流**柱頂部時，加入3CV ddH2O洗柱； 

(3) 待柱中ddH2O流**柱頂部時，加入5CV 1洗柱1×charge buffer； 

(4) 待柱中1×charge buffer流**柱頂部時，加入5CV 1×binding buffer洗柱；柱 填料保存于1×binding buffer中。 2.5.3 重組蛋白的純化 

以超聲上清上樣，分別用10CV 1×binding buffer、10CV 1×wash buffer、3CV 1×elute buffer、3CV 1×strip buffer洗滌層析柱，每1mL收集一管，4oC保存備用。 

 

1.3.4 Ni-NTA 系統緩沖液 

8×binding buffer ：咪唑 40mmol/L ， NaCl 4mol/L ， Tris-Cl （ pH 7.9 ） 160mmol/L，加水**1000mL，調pH **7.9，配制8×binding buffer，工作濃度為 1×binding buffer。 

4×elute buffer：咪唑 4mol/L，NaCl 2mol/L，Tris-Cl （pH 7.9）80mmol/L， 加水**1000mL，調pH **7.9，配制4×elute buffer，工作濃度為1×elute buffer。 8×wash buffer：咪唑 480mmol/L，NaCl 4mol/L，Tris-Cl （pH 7.9） 160mmol/L， 加水**1000mL，調pH **7.9，配制8×wash buffer，工作濃度為1×wash buffer。 4×strip buffer：EDTA 400mmol/L，NaCl 2mol/L，Tris-Cl（pH 7.9） 80mmol/L， 加水**1000mL，調pH **7.9，配制4×strip buffer，工作濃度為1×strip buffer。 8×charge buffer：硫酸鎳 400mmol/L，加水**1000mL，配制8×charge buffer， 工作濃度為1×charge buffer。