一. 實(shí)驗(yàn)原理 

凝膠層析(gel chromatography)又稱為凝膠排阻層析(gel exclusion chromatography)、分子篩層析(molecular sieve chromatography)、凝膠過濾(gel filtration)、凝膠滲透層析(gel permeation chromatography)等。凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當(dāng)含有不同分子大小的組分的樣品進(jìn)入凝膠層析柱后，各個(gè)組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴(kuò)散，組分的擴(kuò)散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。比孔穴孔徑大的分子不能擴(kuò)散到孔穴內(nèi)部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動(dòng)相向下流動(dòng)，它們經(jīng)歷的流程短，流動(dòng)速度快，所以shou先流出；而較小的分子則可以完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，經(jīng)歷的流程長，流動(dòng)速度慢，所以**后流出；而分子大小介于二者之間的分子在流動(dòng)中部分滲透，滲透的程度取決于它們分子的大小，所以它們流出的時(shí)間介于二者之間，分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，各個(gè)組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達(dá)到了分離的目的。 二. 試劑器材 

Sephadex G-75粉末 

洗脫液(10mmol/L Tris，10mmol/L NaCl，pH8.0)：取Tris 1.2114g和NaCl 5.844g分別溶于適量的蒸餾水中，將兩種溶液合并，用4mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值**8.0，再用蒸餾水定容**1000mL； 

其他器材：?18mm試管、層析柱、紫外分光光度計(jì)、分部收集器等 三. 操作步驟 凝膠的制備： 

稱取Sephadex G-75粉末20g，加雙蒸水400ml浸泡，置于水浴鍋中加熱**100℃，保持溫度3hr，冷卻**室溫抽真空30min以排除氣泡，待其沉降后以傾瀉法除去上層懸浮微粒；裝柱： 

取洗凈的內(nèi)徑18mm，長為490mm的層析柱，管底內(nèi)部放置一層絲網(wǎng)，將層析柱垂直，關(guān)閉出水口，加入1/2柱體積的雙蒸水，然后將己溶脹好的凝膠連續(xù)緩慢地從上口加入層析柱中，同時(shí)打開出水口，使凝膠自然沉降； 平衡： 

凝膠床用洗脫液平衡過夜，約2個(gè)柱體積； 加樣： 

稱取樣品溶解于5mL的洗脫液中。先吸去床面上層多余的洗脫液，余2-3mm，關(guān)閉柱出口，將樣品溶液貼著柱的內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)緩慢加入，打開柱出口，讓樣品滲入凝膠床內(nèi)； 洗脫： 

待液面與床面持平時(shí)，先用少量的洗脫液沖洗內(nèi)壁，再用洗脫液進(jìn)行洗脫； 收集： 

用分部收集器收集洗脫液； 蛋白濃度檢測(cè)： 

用分光光度計(jì)以280nm波長紫外光檢測(cè)各試管溶液的吸光值。 四. 注意事項(xiàng) 凝膠的特性要點(diǎn) 

葡聚糖G后面的數(shù)字代表不同的交聯(lián)度，數(shù)值越大交聯(lián)度越小，吸水量越大，其數(shù)值大致為吸水量的10倍。Sephadex對(duì)堿和弱酸穩(wěn)定(在0.1mol/L鹽酸中可以浸泡1-2小時(shí))。在中性時(shí)可以高壓滅菌。不同型號(hào)中又有顆粒粗細(xì)之分。顆粒粗的分離效果差，流速快。顆粒越細(xì)分離效果越好，但流速也越慢。交聯(lián)葡聚糖工作時(shí)的pH穩(wěn)定在2-11的范圍內(nèi)。葡聚糖G型凝膠分離的分子量分級(jí)范圍為700-8×105。 凝膠的溶脹  

G系交聯(lián)葡聚糖凝膠親水性強(qiáng)，只能在水中溶脹(僅有少量的有機(jī)溶劑也可以使之溶脹)，有機(jī)溶劑或含有有機(jī)溶劑較多的水溶液會(huì)改變其孔隙，使之收縮失去或降低凝膠的分離能力。在水中溶脹時(shí)如在室溫則需要較長時(shí)間，才能達(dá)到充分溶脹的程度，但可煮沸到100℃，以縮短其溶脹時(shí)間。