（9）布氏漏斗 （10）抽濾瓶 （11）濾紙 

（12）冷凍離心機 

（13）層析柱（3.5㎝×30㎝） （14）紫外分光光度計 （15）分部收集器 （16）真空泵 （17）真空干燥器  

四、材料與試劑 

 

（1）新鮮雞蛋 

（2）葡聚糖凝膠sephadex G-25（50～100目） （3）丙酮。 

（4）0.5mol/L三氯乙酸（TCA） 

（5）0.02mol/L磷酸緩沖液(pH6.5)取磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀分別把它們配制成0.02mol/L的溶液，再按一定量的比例制成pH6.5 

 

五、操作方法 

 

1．卵類黏蛋白的抽提 

（1）取雞蛋一只，在其底部輕磕一小洞，使蛋清沿小洞慢慢流下，將蛋清液收集到一燒杯中（注意不要使蛋黃混入）。取雞蛋清50mL，在30℃水浴中，緩慢加入等體積的0.5mol/L三氯乙酸-丙酮溶液（三氯乙酸：丙酮＝1:2），邊加邊攪拌，約30min加完，**后溶液的pH＝3.5，繼續(xù)攪拌30min，置于冰箱中靜置4h以上。 

（2）2 500r/min，4℃離心20min，棄去沉淀，清液再用濾紙過濾，以除去其中的脂類物質(zhì)及其他不溶性物質(zhì)。收集濾液并放入500mL燒杯中。 

（3）檢查濾液的pH值是否為3.5，若相差大，則應(yīng)調(diào)回到pH3.5，置冰箱或冰浴下冷卻片刻。 

（4）在冰浴下緩慢加入3倍體積的冷丙酮，用玻璃棒輕輕攪勻，用塑料薄膜蓋好，以減少丙酮的揮發(fā)。在冰浴中放置2h。 

（5）傾出部分上清液，其余全部轉(zhuǎn)移**離心管中，3 000 r/min，4℃離心15 min，傾出上清液，將離心管底部的沉淀物放在真空干燥器內(nèi)，抽氣，除去殘留丙酮，然后用5 mL蒸餾水溶解。若溶解液混濁，可用濾紙去不溶物，將溶解液用Sephed-ex G-25層析柱脫鹽或者透析除鹽。 

2．凝膠層析對卵類黏蛋白提取液的純化 （1）凝膠的預(yù)處理 

為使樣品通過凝膠時流速穩(wěn)定并得到很好的分離效果，應(yīng)該對凝膠進(jìn)行預(yù)處理。稱取30 g Sephadex G-25凝膠，用0.02mol/L磷酸緩沖液（pH6.5）500mL熱溶脹2h或室溫溶脹24h。在凝膠溶脹時避免劇烈攪拌，以防凝膠交聯(lián)結(jié)構(gòu)的破壞。上柱前將處理好的凝膠于真空干燥器中抽氣20～30min。（2）裝柱 

裝柱是凝膠層析中**重要的環(huán)節(jié)，操作時凝膠必須裝得十分均勻，中間不要有氣泡。shou先必須將柱子垂直地安裝好。取0.02mol/L磷酸緩沖液（pH6.5）40mL倒進(jìn)柱內(nèi)，待流出20～30mL后關(guān)閉柱子下端的螺旋夾。然后將脫氣后的凝膠用玻璃棒沿壁小心地緩緩倒進(jìn)柱內(nèi)，盡量一次裝完，以免出現(xiàn)不均勻的凝膠斷層。待凝膠沉降4～5min后打開螺旋夾，待凝膠沉降**床高20㎝處，用吸管吸出過剩的凝膠。用50～100mL磷酸緩沖液(pH6.5)沖洗凝膠柱，使柱床穩(wěn)定，然后在凝膠表面放一片干凈的濾紙，以防加樣時凝膠被沖起。特別要注意在任何時候都不要使液面低于凝膠表面，否則凝膠變干，并有可能產(chǎn)生氣泡，從而影響液體在柱內(nèi)的流動。上樣前要用上述緩沖液平衡凝膠柱，待流出液在紫外分光光度計測出的280 nm吸光值小于0.02時，可停止平衡，開始上樣。 

（3）上樣 

為了獲得較好的分離效果，上樣量要小，**多不能超過床體積的25％～40％。加樣前，關(guān)閉柱下端的螺旋夾，用移液管慢慢地吸走凝膠上層的緩沖液，待床面只留下薄薄一層液體時開始加樣。用移液管吸取5mL雞卵類黏蛋白的粗提液小心地加到凝膠床上。并取走蓋在凝膠上的濾紙。打開柱下的螺旋夾，待樣品完全進(jìn)入凝膠后，加少量磷酸緩沖液潤洗凝膠表面，待液體完全流進(jìn)床內(nèi)后，關(guān)閉螺旋夾，開始洗脫收集。 

（4）洗脫 

在貯液瓶中加入0.02mol/L磷酸緩沖液（pH6.5），控制滴加速度，保證凝膠上方液面高度為10㎝。用下口螺旋夾調(diào)節(jié)流速為0.2～0.5mL/min，打開分部收集器每10min收集一管（3mL／管），用紫外分光光度計測定各管收集液的OD280值，以管號為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪出洗脫曲線，并收集蛋白峰。#p#分頁標(biāo)題#e#