目的：為了使BPG300層析柱裝柱過(guò)程可重復(fù)，并能夠得到較好的柱效，故建立此操作規(guī)范。
范圍：配合ÄKTA process系統(tǒng)進(jìn)行有效的蛋白質(zhì)純化操作。 責(zé)任人：層析工序操作人員 標(biāo)準(zhǔn)操作程序： 1 基本術(shù)語(yǔ)概念
填料因子（Packing Factor, PF）：指在在裝柱過(guò)程中，用低流速（如60cm/h）對(duì)填料進(jìn)行沉降壓縮得到的調(diào)料高度和**后裝柱完成時(shí)填料高度（柱高）的比值，
線性流速（linear flow rate）：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)液體流經(jīng)的直線距離，常用cm/h表示；
體積流速（volume flow rate）：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)液體流經(jīng)的空間容積，常用ml/min表示；
2 準(zhǔn)備工作
2.1 檢查層析柱的完整性，所帶配件，是否水平（用水平儀矯正），是否清潔（如有污染應(yīng)進(jìn)行清洗）。 2.2 確定所用填料及其特性、濃度等
以DEAE Sepharose Fast Flow填料為例，其填料因子（PF）為1.15，新填料（slurry）濃度為75%（保存于20%乙醇中），耐壓3bar。 2.3 確定放大后的工藝參數(shù)
以XX生化制藥股份有限公司的放大工藝為例， 中試工藝參數(shù)：
柱高h(yuǎn)=10cm；體積流速v1=3ml/min；柱內(nèi)徑d=1.6cm. 即，線性流速v2=v1/s柱=3/(3.14×0.82) cm/min=1.5 cm/min； 樣品與填料接觸時(shí)間t=h/v2=10/1.5min=6.67min；
在工藝的線性放大中h、v2和t均不變，則可保證樣品出峰的位置（洗脫時(shí)間）和形狀不變。
使用BPG300層析柱進(jìn)行放大的工藝參數(shù)： 裝柱體積V柱= S柱h=3.14×1.52×1L=7L； 裝柱需要slurry體積Vslurry=V柱×PF/Cslurry 以DEAE Sepharose Fast Flow為填料， 則，Vslurry=7×1.15/0.75L=10.73L；
裝入柱中的slurry高度Lslurry=Vslurry/S柱=10.73/(3.14×1.52)dm=1.52dm=15.2cm. 3管路安裝
3.1 層析柱管道和配件安裝
3.1.1卸下柱子頂部和底部的盲堵墊圈，旋松密封調(diào)節(jié)器，用純水或20%乙醇充分浸潤(rùn)柱內(nèi)壁和柱頭O型圈；
3.1.2 用扳手對(duì)稱(chēng)卸下支持桿連接到法蘭的螺絲，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)高度調(diào)節(jié)手柄將柱頭旋****高處，在柱頭頂部依次安裝壓力表和四路二通閥，在柱底安裝四路二通閥；
3.1.3在頂部四路二通閥上橫向連接一根細(xì)管，另一端連**ÄKTA process上端連接口COLUMN TOP，同時(shí)從柱底四路二通閥橫向接出一根細(xì)管**ÄKTA process的下端連接口COLUMN BOTTOM。
3.2層析柱下端篩網(wǎng)排氣泡
3.2.1連接兩根足夠長(zhǎng)的細(xì)管到ÄKTA process進(jìn)樣泵的A1和B1進(jìn)口，兩管另一端均放入純水中；
3.2.2從A1泵入純水：打開(kāi)UNICORN軟件，在system control窗口點(diǎn)擊manual→valves→InletA，選擇inletA1，insert；InletB，選擇closed，insert；
Column，選擇upflow，insert；Pump→Flow，設(shè)定流速60L/h，點(diǎn)擊execute運(yùn)行程序充水**BPG柱中2-3cm左右，pause，清除下端篩網(wǎng)中的空氣，用注射器吸出篩網(wǎng)中殘留的氣泡。 4裝填料 4.1準(zhǔn)備填料
所用填料為DEAE Sepharose Fast Flow ，裝置的是保存于20%乙醇中的新slurry；
4.2卸下柱頭，用攪拌棍引流加入混勻的slurry**15.2cm處，再加入純水**40cm左右，充分?jǐn)嚢杌靹颍瑫r(shí)避免擠壓篩網(wǎng)和柱壁，靜置使填料界面**少低于38cm；
4.3在system control窗口點(diǎn)擊manual→valves→InletA，選擇inletA1，insert；InletB，選擇closed，insert；Column，選擇downflow，insert；Pump→Flow，設(shè)定流速60L/h，點(diǎn)擊execute運(yùn)行程序?qū)⒅^上端篩網(wǎng)充滿水以除去氣泡，再裝上柱頭，用密封調(diào)節(jié)器固定柱頭，擰緊螺絲；
4.4在system control窗口點(diǎn)擊manual→Pump→Flow，設(shè)定流速為42L/h（60cm/h），進(jìn)行填料的沉降，待填料高度降**14cm左右，將密封調(diào)節(jié)器旋**全松，將柱頭快速調(diào)**距離填料3-4cm處，將密封調(diào)節(jié)器旋**半松，將柱頭快速調(diào)**濾網(wǎng)距離填料1-2cm，旋緊密封調(diào)節(jié)器，再設(shè)定高流速（如150L/h），繼續(xù)壓縮填料，**后再調(diào)節(jié)柱頭**10cm。整個(gè)過(guò)程一直有流速，泵速不能停。 5 柱效測(cè)定
圖2、柱效測(cè)定示意圖
5.1 平衡
將A1接口細(xì)管放入0.4M NaCl溶液中，將柱頂端四路二通閥調(diào)**管路與大氣相連狀態(tài)，在system control窗口點(diǎn)擊manual→valves→InletA，選擇inletA1，insert；InletB，選擇closed，insert；Column，選擇downflow，insert；Pump→Flow，再設(shè)定高流速（如150L/h），點(diǎn)擊execute運(yùn)行，排氣泡，再將閥調(diào)**管路與柱頭相連狀態(tài)，平衡3-5個(gè)柱體積**電導(dǎo)曲線穩(wěn)定，點(diǎn)擊END； 5.2上樣
5.2.1將B1接口細(xì)管放入2M NaCl溶液，柱頂端四路二通閥調(diào)**管路與大氣相連狀態(tài)，在system control窗口點(diǎn)擊manual→valves→InletA，選擇Closed，insert；InletB，選擇InletB1，insert；Column，選擇downflow，insert；Pump→Flow，設(shè)定高流速（150L/h）點(diǎn)擊execute運(yùn)行，排氣泡，pause； #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
5.2.2 在system control窗口點(diǎn)擊manual→Other→End_Timer，選擇Acc. Volumn, Timeout 設(shè)上樣量為70mL（1%柱體積）；Pump→Flow，設(shè)定上樣流速60L/h，點(diǎn)擊execute的同時(shí)將柱頂端四路二通閥調(diào)**管路與柱頭相連，完成上樣； 5.3 洗脫
5.3.1 將柱頂端四路二通閥調(diào)**管路與大氣相連狀態(tài)，在system control窗口點(diǎn)擊manual→valves→InletA，選擇inletA1，insert；InletB，選擇closed，insert；Column，選擇downflow，insert；Pump→Flow，設(shè)定高流速（150L/h）點(diǎn)擊execute運(yùn)行，排氣泡，同時(shí)將管路充滿0.4M NaCl溶液，調(diào)流速**21L/h（30cm/h）；
5.3.2 待流速穩(wěn)定后，在system control窗口點(diǎn)擊manual→valves→Injection Mark，insert，點(diǎn)擊execute的同時(shí)將柱頂端四路二通閥調(diào)**管路與柱頭相連，開(kāi)始洗脫，在一個(gè)柱體積左右，電導(dǎo)檢測(cè)下將產(chǎn)生目的峰。 5.4 測(cè)柱效
在Evaluation窗口中，選擇實(shí)驗(yàn)保存的結(jié)果，在結(jié)果圖中點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，選擇Properties，點(diǎn)擊Clear，并選中Cond_102，點(diǎn)擊OK。回到Evaluation窗口，選擇積分按鈕，在彈出窗口中，選擇Cond_102，peak window中調(diào)整積分的范圍，并在Reject Peaks中，填Peak must be one of 1 largest；確定后，在積分結(jié)果窗口，點(diǎn)擊右鍵，選擇Properties，在peak table選項(xiàng)中，勾選Plate Height（HETP）和Asymmetry。確定后即可計(jì)算得到計(jì)算理論塔板高度HETP和對(duì)稱(chēng)因子As。
